探究不同理化因素對重組人成纖維細(xì)胞生長因子21蛋白純度的影響論
成纖維細(xì)胞生長因子21 (fibroblast growthfactor 21，F(xiàn)GF21)是最新被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，屬于成纖維細(xì)胞生長因子19 (fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19) 亞族。FGF21作為 FGF家族的新成員，其具有調(diào)控多種內(nèi)分泌功能[4]。研究顯示：FGF21的功能主要表現(xiàn)在糖脂代謝的調(diào)節(jié)上，其可以不依賴于胰島素而使血糖降低，同時(shí)可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，緩解 脂 肪 肝 動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化。近 年 來 在 國 際 上FGF21已成為糖尿病、脂肪肝、肥胖癥和代謝綜合征等代謝疾病研究的熱點(diǎn)藥物，未來有可能替代胰島素成為治療糖尿病的新藥。最新研究,表明：FGF21能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激帶來的損傷。美國Lilly公司已開展FGF21的Ⅱ期臨床觀察。但對重組人 FGF21 (rhFGF21)的穩(wěn)定性研究目前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用已構(gòu)建的高表達(dá)FGF21蛋白基因工程菌株，經(jīng)發(fā)酵純化后，獲得純度大于95%的蛋白，對其穩(wěn)定性做進(jìn)一步觀察和測定，以便為制定rhFGF21的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，也可為其他蛋白質(zhì)類藥物的開發(fā)和生產(chǎn)提供有益參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器 三氟乙酸和乙腈均為色譜純;其他試劑均為分析純;rhFGF21原液由吉林醫(yī)藥學(xué)院王會(huì)巖博士提供，純度>99%。高效液相色譜儀 (E2695，紫 外 檢 測 器，美 國 Waters公司)。
1.2 不同溫度時(shí)rhFGF21純度檢測 將一定數(shù)量的樣品放置于25℃、4℃和-20℃下保存，對4℃和25℃樣品每周取樣品若干支進(jìn)行外觀形狀觀察和 HPLC法檢測rhFGF21純度，-20℃樣品保存12個(gè)月，每6個(gè)月取樣品3支進(jìn)行檢測，同時(shí)觀察外觀性狀。
1.3 不同緩沖體系和pH 值時(shí)rhFGF21純度檢測 緩沖體系終濃度為20mmol·L-1，蛋白水平為0.5g·L-1，醋酸-醋酸鈉緩沖液 pH 4.0和 pH5.0、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris-HCl緩沖液pH 7.5和pH 8.0，分別于每7d取3支樣品觀察rhFGF21原液的外觀性狀變化并對其純度進(jìn)行測定。
1.4 反復(fù)凍融處理后rhFGF21純度檢測 將一定數(shù)量rhFGF21原液于-20°C凍存，每日固定時(shí)間將其融化，然后置于-20°C凍存，如此重復(fù)持續(xù)12d，每3d觀察rhFGF21原液外觀性狀的變化并對其純度進(jìn)行測定。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。rhFGF21純度檢測結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用單因素方差分析。
2 結(jié) 果
2.1 色譜條件 色譜柱為 C18柱 (250×4.6mm，5μm);流動(dòng)相：A 相為 0.1%三氟乙酸-注射用水;B 相 為 A 甲醇，C 和 D 相 均 為 水;流 速0.5mL·min-1;檢測波長280nm;平衡用100%A泵液體至基線穩(wěn)定，洗脫采用不同濃度梯度A泵逐級(jí)洗脫，進(jìn) 樣 量 10μL。rhFGF21 原 液HPLC色譜圖見圖1。
2.2 不同溫度時(shí)rhFGF21的純度 25℃時(shí)，存放14d時(shí)rhFGF21純度 (15.20%±0.14%)較0d時(shí) (100.00%±0.00%)下降，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義 (P<0.05)。4℃ 時(shí)，存 放 35d 時(shí)rhFGF21純度下降至 (89.30±0.39)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。-20℃時(shí)，存放 6="" 99.10="" p="">0.05);存 放 12 個(gè) 月 時(shí) rhFGF21 純 度 下 降 至(95.30±0.39)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。王長文，等 . 不同理化因素對重組人成纖維細(xì)胞生長因子21蛋白純度的影響705
2.3 不同緩沖體系和 pH 值時(shí)rhFGF21純度 25℃條件下rhFGF21在不同pH 值的緩沖體系中保存7d后，pH 4.0和pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液 出 現(xiàn) 渾 濁，rhFGF21 純 度 分 別 下 降 至(30.60±0.12)%和 (45.60± 0.30)%;pH 5.0和pH 6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液出現(xiàn)渾濁，純度降至 (55.90±0.90)%和 (65.90±0.82)%;pH6.0、pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，pH 6.0緩沖液渾濁，純度為 (71.10±0.65)%，pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液澄清透明，純度為 (75.10±0.45)%和 (80.50± 0.02)% ;pH 7.5和pH 8.0Tris-HCl緩沖液中，pH 7.5緩沖液澄清透明，純度為(81.50±0.22)%和 (78.40±0.37)%。以上不同pH 值 的 緩 沖 液 保 存 后， 與 對 照 組(100.00%±0.00%)比較，rhFGF21純度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。
2.4 反復(fù)凍融后rhFGF21的純度 rhFGF21原液反復(fù)凍融后，肉眼觀察的結(jié)果和純度檢測一樣，0～3d瓶內(nèi)液體仍澄清，無不溶物出現(xiàn)，反復(fù)凍融3d后，rhFGF21純度 [(90.80±0.01)%]與對照組 [0d， (100.00±0.00)%]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05);6～12d時(shí)，發(fā)現(xiàn)肉眼可見的不溶物;反復(fù)凍融6、9和12d后rhFGF21純度分別為 (90.80±0.01)%、 (82.5±0.02)%和 (70.6±0.02)%，與對照組 (0d)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。
3 討 論
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，在臨床治療上蛋白質(zhì)藥物已得到大量應(yīng)用，然而由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不好，易失去活性，限制了部分蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用。眾所周知，蛋白質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定性較差，這是由于蛋白質(zhì)在水溶液中容易發(fā)生物理或化學(xué)方面的某些變化。某些物理因素如溫度、離子強(qiáng)度、渦流、表面吸附和化學(xué)降解及修飾作用等均會(huì)增加疏水表面積從而影響蛋白質(zhì)的.聚合行為，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性降低甚至消失、溶解性的降低和免疫原性的改變。 最 新 研 究表 明： 聚 乙 二 醇(polyethylene glycol，PEG)修飾、pH 值敏感型聚合物水凝膠等均可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。雖然溫度是影響蛋白質(zhì)和多肽穩(wěn)定性最重要的因素，但其影響機(jī)理尚未明確。通常認(rèn)為：溫度越高，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越差。本研究中rhFGF21在水溶液中隨著溫度的升高穩(wěn)定性下降，可能是由于高溫使其化學(xué)降解過程加速。由于蛋白質(zhì)在胞內(nèi)處于中性環(huán)境中，非常穩(wěn)定。但當(dāng)純化后在水溶液中穩(wěn)定性較差。本研究結(jié)果顯示：rhFGF21的穩(wěn)定性在pH 6.5～8.0 溶液中優(yōu)于酸性或堿性溶液，而且表現(xiàn)出酸性越強(qiáng)其穩(wěn)定性越差的趨勢，極端的pH 值會(huì)降低鹽橋的形成能力，從而導(dǎo)致其穩(wěn)定性上的降低。一些蛋白質(zhì)對溶液的反復(fù)凍融很敏感。本研究中rhFGF21對凍融非常敏感，在以后的生產(chǎn)中要盡量避免反復(fù)凍融。
綜上所述，rhFGF21于低溫和pH 6.5～8.0接近中性條件下呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。而高溫、偏酸性和偏堿性條件對rhFGF21的穩(wěn)定性不利。磷酸鹽緩沖液對rhFGF21穩(wěn)定性呈現(xiàn)出較好的作用。反復(fù)凍融處理對rhFGF21穩(wěn)定性具有明顯的影響。本實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 將 為 rhFGF21 純 化 工 藝 的 研 究、rhFGF21質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和蛋白質(zhì)藥物制劑開發(fā)提供依據(jù)。
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