組合添加代謝調控劑對肌苷發(fā)酵及其代謝流分布的影響分析論文
1引言
肌苷又稱次黃嘌呤核苷，它在食品和醫(yī)藥等領域有著廣泛的用途.肌苷是食品工業(yè)中肌苷酸的原料，同時也是各種調味食品的營養(yǎng)助鮮劑;在醫(yī)藥上，肌苷能預防及解除由血防藥物引起的對心臟或肝臟的副作用，是治療冠心病、肝炎、白血球減少癥等的良效藥物。
通過研究細胞代謝流的動態(tài)變化，對發(fā)酵過程進行優(yōu)化是目前研究的熱點。而根據細胞生長和產物合成的代謝調控機理，添加代謝調控劑對代謝過程進行調控，成為增加產物產量的有效方式。發(fā)現添加檸檬酸可以減小糖酵解途徑(EMP)的代謝通量，同時增大磷酸戊糖途徑(HMP)和三梭酸循環(huán)(TCA)的代謝通量，從而造成核糖合成代謝流的增加，使糖產量得到顯著提高。劉新星等在基礎培養(yǎng)基中添加0.2 g的檸檬酸鈉，使糖酵解途徑中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力降低，從而減弱了糖酵解途徑的通量，肌苷產量提高了18%。陳雙喜等在肌苷搖瓶發(fā)酵過程中添加10 g，的葡萄糖酸鈣，能夠誘導葡萄糖酸激酶的生成，增大磷酸戊糖途徑的代謝通量，肌苷-產率由10.76 g提高到18.36 g。
對于肌苷生產來說，糖酵解途徑代謝流的減弱會導致代謝流在EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間的重新分配，使更多的碳源轉向HMP途徑，從而為肌苷的合成提供更多的前體。因此，只要添加對代謝途徑關鍵酶具有特定調控作用的代謝調控劑，就可以有效地增加肌苷的發(fā)酵產量。不過，在發(fā)酵過程單一添加一種代謝調控劑，僅針對肌苷，生物合成過程中的一種或少數幾種關鍵酶進行調節(jié)，其他的限制肌苷，合成的調控節(jié)點并沒有得到改善。而如果在發(fā)酵過程中組合添加代謝調控劑，使多個關鍵節(jié)點同時得到有效調控，有可能使肌苷產量得到進一步的提高，這方而的研究還未見報道。因此，木實驗根據肌苷-的合成機理，選擇對肌苷，生物合成過程具有特定調控作用的代謝調控劑，在考察單一添加代謝調控劑對肌苷生物合成影響的基礎上，組合添加這些代謝調控劑，對肌苷生物合成過程的多個關鍵代謝調控節(jié)點進行調控，增大流向肌苷合成的代謝流，使肌苷產量得到顯著提升。進而利用代謝通量分析的方法，對組合添加代謝調控劑提高肌苷產量的代謝調控機理進行深入分析。
2結果與討論
2.1單一代謝調控劑的選擇及其對肌苷發(fā)酵的影響
相關研究表明，在發(fā)酵過程添加檸檬酸鈉或葡萄糖酸鈣，可以對6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶或葡萄糖酸激酶等代謝途徑中的關鍵酶進行調節(jié)，抑制EMP途徑并增大HMP途徑的代謝通量，引起代謝流朝向有利于肌苷-合成的方向遷移。在初始培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的檸檬酸鈉或葡萄糖酸鈣，檢測發(fā)酵肌苷產量和生物量。
適量添加檸檬酸鈉可以提高枯草芽抱桿菌的肌苷產量。其中，在培養(yǎng)基中添加3 g檸檬酸鈉，肌苷產量比對照組增加13.9%。檸檬酸和葡萄糖的聯合代謝可增加C a2的吸收，對丙酮酸激酶產生強烈抑制，造成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的累積，PEP是磷酸果糖激酶的強烈抑制劑，丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途徑的關鍵酶，造成EMP途徑通量減弱，導致更多的碳源進入HMP途徑。
在培養(yǎng)基中添加葡萄糖酸鈣，肌苷發(fā)酵產量比對照組增加27.8%。在枯草桿菌中，少量葡萄糖經葡萄糖脫氫酶生產葡萄糖酸，然后在葡萄糖酸激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸，進入HMP途徑，加入葡萄糖酸鈣可以大幅度提高葡萄糖酸激酶的比活，增大HMP途徑的通量，一方而促進菌體合成，另一方而為肌苷合成提供較多的前體物質，提高肌苷的產率。
根據類似的調節(jié)機理，選擇烯醇化酶抑制劑、酸酶激活劑、和肌苷合成的前體次黃嘌呤核苷等三種代謝調控劑，分別考察其不同的的添加量對肌苷合成的影響。
適量的添加NaF對肌苷產量具有顯著的提高作用，當添加2 mg時，肌苷產量比對照組提高了23.9% 。因此，添加適量的NaF可以減弱糖酵解途徑通量，使更多的糖進入HMP途徑為肌苷的生物合成提供更多的前體，從而提高了肌苷產量。
適量添加氯化鈣對枯草芽抱桿菌的生長以及肌苷-的積累均有一定的促進作用。其中，當添加5 mg，的CaClz時，生物量可以達到最大值;而當加入10 mg，的C aC 1z時，肌苷產量達到最大值，比對照組的肌苷-產量高出了23.1%。這主要是因為CaCI的添加可以提高。酸酶的活力，而酸酶是肌苷合成途徑中的關鍵酶，酸酶活力的增加有助于肌苷的積累，因此CaCI的適量添加有助于肌苷產量的`提高。
添加適量的次黃嘌呤核苷對枯草芽抱桿菌的生長沒有明顯的促進作用，但對肌苷產量的積累卻有顯著地提高作用，尤其當添加0.15%次黃嘌呤核苷時，肌苷產量比對照組提高了89.9%，這與次黃嘌呤核苷，合成途徑的前體物質有關，加入的次黃嘌呤核苷為枯草芽抱桿菌提供了完整的吟環(huán)，從而使得枯草芽抱桿菌便于通過補救途徑大量合成肌苷。
2.2組合添加代謝調控劑對肌苷發(fā)酵的影響
針對肌苷，合成過程的代謝調控節(jié)點，在發(fā)酵過程分別添加NaF、次黃嘌呤核苷、葡萄糖酸鈣、C aC 1z和檸檬酸鈉等五種代謝調控劑，使代謝流朝向有利于肌苷-合成的方向，可以有效地提高發(fā)酵過程的肌苷，產量。不過，在發(fā)酵過程單一添加一種代謝調控劑，僅針對肌苷，生物合成過程中的少數節(jié)點進行調控，其他的限制肌苷，合成的關鍵節(jié)點并沒有得到改善。因此，在發(fā)酵過程中組合添加這五種代謝調控劑，同時對肌苷，合成的多個關鍵節(jié)點進行調控，以使肌苷-合成的代謝流得到進一步的增大，促進肌苷產量的進一步提高。
2.3組合添加代謝調控劑對肌苷發(fā)酵影響的代謝通量分析
在進行代謝通量分析時，主要針對枯草芽抱桿菌發(fā)酵中后期這段時間進行代謝通量分析，因為該階段肌苷，的積累速率達到最大，同時細胞的生長處于穩(wěn)定期，此時關于細胞代謝過程的擬穩(wěn)態(tài)假設更接近成立。
以上這些結果表明，減弱EMP途徑的代謝流量以及增大HMP途徑的代謝流量，可以促進肌苷合成。
單一添加代謝調控劑，僅針對一個或少數幾個節(jié)點進行調控，葡萄糖代謝流在各分支途徑中的分配遠未達到最佳，肌苷產量提高有限。相比之下，在發(fā)酵過程組合添加不同的代謝調控劑，可以同時對多個代謝調控節(jié)點進行調控，使得葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生較大程度的遷移，實現對葡萄糖主體代謝流分布的調整，促使肌苷的產率得到顯著的提高。
3結論
根據枯草芽抱桿菌生物合成肌苷的代謝調控機理，選擇五種有利于肌苷積累的代謝調控劑: 次黃嘌呤核苷、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉。在培養(yǎng)基中組合添加這些代謝調控劑時，肌苷產量得到進一步提高，當組合添加2 mg，0.15%次黃嘌呤核苷、15 g葡萄糖酸鈣和10mgCaClz時，肌苷-的產量達到了14.01 g，相比不添加代謝調控劑的空白對照組肌苷產量增加了3.39倍。對代謝網路各分支途徑的代謝通量變化進行測定，從代謝調控的角度確證了組合添加代謝調控劑，針對多個代謝調控節(jié)點進行調控，可以實現葡萄糖代謝流中各分支途徑的合理分配，促使發(fā)酵過程的葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生遷移，肌苷產量得到顯著提升。
【組合添加代謝調控劑對肌苷發(fā)酵及其代謝流分布的影響分析論文】相關文章：
PM2.5對運動的影響論文開題報告01-10
家庭教育對幼兒的影響論文開題報告10-24
小議病案管理對醫(yī)療保險的影響論文08-10
關于論文構思提綱運用對寫作成績的影響07-01
廣西生育保險政策對基金支出的影響研究論文08-09
有關PM2.5對運動的影響的論文開題報告10-06
構思階段的提綱運用對寫作成績的影響論文07-03